Дмитрий Марфунин
"О туберкулезе"
09 апрель 2011
Как известно, Mycobacterium tuberculosis (Mtb) – это тонкая палочковидная клетка, длиной 1-10 мкм, шириной 0,2-0,7 мкм, неподвижная, кислотоустойчивая. Она является облигатным аэробом, но в неблагоприятных условиях может трансформировать метаболизм и становиться анаэробом. Растет очень медленно на плотных средах. На жидких средах Mtb в связи с резко выраженной гидрофобностью растет на поверхности, образуя пленку, которая распространяется однородно по всей поверхности среды, то есть на границе жидкой и воздушной среды. Бульон остается прозрачным.
Одной из характерных особенностей Mtb является уникальное строение ее клеточной оболочки. Она состоит до 60% из широкого разнообразия сложных липидов. Этот липидный низкопроницаемый матрикс обеспечивает ее врожденной устойчивостью к лекарствам и иммунной защите. Арабиногалактан-пептидогликановый комплекс образует основу оболочки [2]. Главным же элементом этой защитной оболочки являются миколовые кислоты [31]. Приблизительно половина массы клеточной оболочки состоит из жирных кислот с большой разветвленной цепью (С70-С90), названных миколовыми кислотами. Миколовые кислоты Mtb являются самыми длинными и имеют наибольшие боковые цепи (С20-С24) [18]. Миколовые кислоты – это бета-гидрокси жирные кислоты с длинной альфа-алкилированной боковой цепью, альфа-миколовая кислота является самой богатой формой (>70%) и представляет собой cis,cis-дициклопропил жирную кислоту. Циклопропановое кольцо в миколовых кислотах Mtb способствует структурной целостности комплекса клеточной стенки и защищает бациллу от оксидантного стресса [31].
Внутренний слой внешней мембраны составлен из миколовых кислот, ковалентно связанных с арабиногалактаном и образующих арабиногалактан-миколат. Внешний слой состоит из гликолипидов, содержащих миколовые кислоты, ковалентно не связанных с арабиногалактаном [18, 31]. Эти гликолипиды формируются из трегалозы-6-мономиколата (ТММ), который продуцируется в клетке, но немедленно транспортируется из клетки АВС транспортером, не накапливаясь в цитоплазме [31]. Этот механизм позволял быструю и эффективную передачу ТММ от внутренней части за пределы клетки для синтеза арабиногалактан-миколата и трегалозы-6,6`-димиколата (TDM), что было необходимым условием для нормального роста Mtb [18, 31]. TDM связан с образованием лент или жгутов в жидкой среде (см. ниже), поэтому он назван фактором жгутообразования или cord factor и считается фактором вирулентности [18], хотя вклад TDM в вирулентность Mtb все еще спорен [14].
Конечные продукты клеточной оболочки арабиногалактан-миколат и TDM формируются из ТММ под действием внеклеточной миколилтрансферазы, названной Ag85 [31]. Ag85 – самый богатый белок, секретируемый Mtb (~10-30%), и считается фактором вирулентности [18]. Mtb экскретирует обильное количество Ag85 в питательную среду, где она с готовностью доступна для вышеупомянутых двух реакций вне клетки [31]. Во всяком случае, только следы липидов найдены потерянными в микобактериальных культурах [2].
У Mtb существует система секреции, вовлеченная в вирулентность и названная ESX-1 (ESAT-6 secretion system 1). Это тип VII секреции, транспортирует свои главные субстраты через кольцо в клеточной оболочке. Белки, секретируемые ESX-1 и вовлеченные в вирулентность, включают ESAT-6 (early secreted antigenic target–6kD), его шаперон CFP-10 (culture filtered protein 10), а также EspR (ESX-1 секретируемый белок регулятор), подразделяемый на EspA и Mh3881c [24].
В бактериальной цитозоли С-терминал Mh3881c последовательности взаимодействует с ESAT-6, и это взаимодействие необходимо для секреции ESAT-6 [30]. EspR – это ДНК-связывающий фактор транскрипции, который регулирует гены Mtb, которые требуются для ESX-1, и отрицательно регулирует систему секреции этого фактора вирулентности. То есть секреция EspR функционирует через ESX-1 путь, чтобы ограничить ее внутриклеточную активность, функционально соединяя транскрипцию и секрецию в системе ESX-1. Секреция транскрипционных регуляторов чрезвычайно редка в биологии, только с тремя другими примерами в прокариотах, ни один из которых не связывается непосредственно с ДНК [24].
ESAT-6, но не другие ESX-1 секретируемые белки, в состоянии вызвать дозозависимое формирование поры в мембранах клеток хозяина. Очищенный ESAT-6 индуцирует мембранные поры диаметром около 4,5 нм, которые несколько меньше, чем произведенные бактериями, предполагая, что количество молекул ESAT -6 для формирования поры может определять размер поры [30]. Считается, что образующаяся пора используется для выхода Mtb из фагосомы. Но, как выше было указано, минимальный размер Mtb 0,2 мкм или 200 нм при ее неподвижности.
Известно, что когда Mtb клетки растут в жидкой среде, они формируют микроскопические структуры – прочные связки или ленты, напоминающие клеточный столбик, известное как образование жгута или ленты и считающееся фактором вирулентности. Они состоят из бацилл, у которых ориентация длинной оси каждой клетки параллельна к длинной оси ленты. Лентообразование может быть связано с липидом трегалозы димиколатом, который и был назван фактором жгутообразования. Но лентообразование может быть связано с мутациями в генах, непосредственно не вовлеченных в биосинтез трегалозы димиколата. Непатогенные микобактерии также формируют микроскопические ленты [15].
Показано, что когда Mtb растут на жидких питательных средах, они формируют пленки, распространяющиеся однородно по всей поверхности жидкости и поднимающиеся вверх по стенке стеклянного контейнера [15]. Известно также, что ESX-1 система локализуется на полюсах бактериальной клетки [29]. Так как в лентах или жгутах Mtb соединяются полюсами, можно предположить участие в этом процессе ESX-1 системы, так как известно, что ее продукты, попадая в цитозоль, полимеризуют актин [30]. А так как в жидких средах Mtb растет в виде пленки на границе жидкой и воздушной среды, а также распространяясь вверх по стенке контейнера, будучи аэробом и неподвижной, то все это можно расценить как попытку ухода из неблагоприятной среды, а ESX-1 как систему, способствующую этому процессу.
У Mtb не хватает классических факторов вирулентности, таких как токсины [8]. Липиды наружной мембраны напоминают липополисахариды грамотрицательных бактерий, но лишены их агрессивности. Таким образом, можно думать о том, что все ее факторы вирулентности могут быть расценены или как защита от неблагоприятных условий внешней среды или же как попытка уйти от них.
Инфицирование происходит, как правило, аэрозольным путем. Mtb вдыхаются как каплеобразные ядра, оценки инфекционной дозы колеблются от единственной бактерии и более [28]. Диаметр инфекционного каплеобразного ядра ~1-3 мкм и его содержание – 1-3 бациллы [12]. Более крупные ядра оседают в дыхательных путях, не достигая альвеол, а для успешного инфицирования, очевидно, необходимо проникновение Mtb в альвеолы, где они захватываются альвеолярными макрофагами. Наряду с альвеолярными макрофагами, после введения аэрозоля с Mtb в легкие становятся инфицированными также миелоидные дендритные клетки легких, рекрутированные внутритканевые макрофаги, моноциты и нейтрофилы [1]. Но взаимоотношения Mtb и альвеолярного макрофага крайне важны для развития болезни.
Mtb взаимодействует с различными рецепторами на поверхности макрофагов и дендритных клеток (DC): toll-like рецепторы (TLR), рецепторы комплемента (CR)1,2,3,4, маннозы рецептор (MR), scavenger рецептор (SR), DC-специфический внутриклеточной молекулы адгезии-3-захвата не интегрин (DC-SIGH) [5, 25]. Но макрофаги развили ограниченное число фагоцитарных рецепторов, названных рецепторами распознавания образов (PRRs), которые признают сохраненные мотивы на поверхности микроорганизмов. Такие рецепторы включают С-типа лектина маннозный рецептор (MR) и уже упоминавшийся DC-SIGH. Эти рецепторы отмечает факт, что они опосредуют поглощение микроорганизмов, но не обязательно провоцируя провоспалительную реакцию [17].
Альвеолярные макрофаги – прототипические альтернативно активированные клетки с высокой MR активностью [17]. Взаимодействия между MR на макрофагах и Mtb опосредовано через липоарабиноманнан (LAM) [25]. Маннозы терминал оболочки Mtb ManLAM задействует MR во время фагоцитарного процесса макрофагами [17]. Обращает на себя следующий факт: связывание Mtb рецепторами макрофага без фагоцитоза не изменяет генную экспрессию Mtb [26], то есть Mtb никак не реагирует на контакт с макрофагом и остается пассивной, чего нельзя сказать о макрофаге.
Обычно после фагоцитоза макрофагом патогенных микробов фагосома, содержащая патогены, созревает и сливается с лизосомой (Ф-Л слияние). Период задержки 2 часа типичен для слияния с лизосомами [13]. LAMP (лизосома-ассоциированный мембранный протеин) появляется в фагосомной мембране через 20 мин после фагоцитоза и концентрация увеличивается шестикратно в следующие 2 часа, что показывает эффективность макрофагов в трафике патогенов в компартемент, развитый, чтобы убить их [32].
Критическая особенность патогенеза туберкулеза – способность Mtb уклонятся от бактерицидных активностей макрофага и сохраняться как внутриклеточный паразит в пределах мембраной окруженных пузырьков [21]. Препараты клеточной оболочки патогенных микобактерий способны к уменьшению фагосом созревания и слияния с лизосомами [13]. Точная природа маннозы ограниченного ManLAM и его предъявление может воздействовать на узнавание MR и реакцию хозяина [17].
MR может избирательно сортировать фагоцитированные частицы к нелизосомным компартементам. Регулируя самое раннее фагосомальное движение после фагоцитоза, MR фагоцитарный путь позволяет ManLAM-содержащей Mtb избежать Ф-Л слияния. Этот процесс является специфическим для MR и ManLAM, так как вход через другой С-типа лектина PRR, DC-SIGH, не опосредует этого эффекта. Моноциты, которые не экспрессируют MR, не способны к ограничению Ф-Л слияния [17]. Ограничение Ф-Л слияния может быть реверсировано или блокируя MR или маскируя маннозу оболочки ManLAM предварительной обработкой витамином D3 [13] или белком D сурфактанта [6], что переадресовывает ManLAM ко входу через другие фагоцитарные рецепторы, вызывая созревание фагосом [17].
Ингибиция передачи сигналов макрофага ограничена живыми бациллами. Фагосомы, которые охватывают убитые Mtb, обычно созревают в фаголизосомы [23]. Инактивированный высокой температурой штамм Mtb не избегает фагосомального созревания в отличие от дикого типа [7].
Экспонированные поверхностные молекулы убитых Mtb глобально изменены и будут взаимодействовать с макрофагом очень отлично от живых микобактерий. Живые бациллы сохраняют большее количество ManLAM на своей поверхности, чем убитые бациллы, выдвигая на первый план важность архитектуры интактной микобактериальной клеточной оболочки в ранних хозяин-микроб взаимодействиях [17].
Все вышеизложенное позволяет думать о том, что макрофаг «узнает» живую Mtb до фагоцитоза и уже до фагоцитоза запускает программу ограничения Ф-Л слияния, при пассивности Mtb.
Инкубация макрофага с серологически-опсонизированными убитыми Mtb вызвала значительное увеличение цитозольного Са2+ в макрофагах и кинетика этого увеличения была неотличима от индуцированного другими комплемент-опсонизированными частицами. Фагоцитоз живой вирулентной Mtb макрофагами является не связанным с увеличениями цитозольного Са2+, что обычно следует за микробным поглощением. Живая, серологически-опсонизированная Mtb не вызвала изменения в цитозольном Са2+, несмотря на то, что была фагоцитирована тем же самым расширением, как и убитые организмы [26].
Маловероятно, что такие индуцированные изменения путей трансдукции сигнала макрофага исходили от пассивной (на начальных стадиях) Mtb, которая практически лишь присутствовала в фагосоме. Скорее можно думать о том, что макрофаг уже был примирован на захват и сохранение Mtb в клетке.
Адаптация Mtb в фагосоме – быстрый и непрерывный процесс [26]. Mtb регулирует свой метаболизм дифференцированно во время прогрессии болезни [28]. Окисление вакуоли – важный триггерный механизм для дифференциальной генной экспрессии Mtb. Mtb вакуоль характеризована неполным окислением из-за ограниченного накопления вакуольных АТФаз и неспособности приобретать лизосомную GTPase или зрелые лизосомные гидролазы. Но даже минимальное окисление Mtb вакуоли могло влиять на бактериальный рост и генную экспрессию в пределах макрофага. В раннее время после инвазии покоящегося макрофага умеренное окисление Mtb фагосомы служит важным стимулом для транскрипционной адаптации к этой внутриклеточной нише. Наблюдается прямая причинная связь между стимулом вакуоли (рН) и транкрипционной реакцией [26].
Большинство генов Mtb, требуемых для внутриклеточного выживания, являются конститутивно экспрессируемыми [26]. Гены, продукты которых вовлечены в аэробное дыхание, подавлялись у внутриклеточных бактерий [22]. После начальной адаптации к гипоксии длительное выживание Mtb достигается устойчивой гипоксической реакцией [10].
Фагосомой рано индуцировались гены, вовлеченные в метаболизм жирных кислот [26]. Mtb переключает метаболический путь, чтобы использовать во время персистенции жирные кислоты, а не углеводы. Одна из метаболических адаптаций – анаплеротическое использование внутриклеточных источников углерода через глиоксилатный шунт фермента изоцитрат лиазы [10]. Изоцитрат лиаза является вентильным ферментом в глиоксилатном шунте и мобилизована, когда организмы растут на жирных кислотах как их ограниченном источнике углерода [27]. Индукция генов, вовлеченных в бета-окисление жирных кислот, и рекрутирование изоцитрат лиазы во время персистенции инфекции предполагает, что фагосомы навязывают пищевые ограничения, которые вызывают метаболические изменения с опорой на жирные кислоты. Разнообразие профиля экспрессии генов, вовлеченных в липидный метаболизм, может отражать колебания в природе (длина цепи, степень насыщенности) и изобилии жирных кислот субстратов, доступных Mtb in vivo [26]. Так Mtb кодирует и синтезирует ферменты, чтобы использовать триацилглицериды (TAG) [20].
Отмечено также, что у внутриклеточной Mtb положительно регулировались гены, вовлеченные в синтез клеточной оболочки. Модернизация клеточной оболочки в пределах фагосомы может быть важной адаптацией к внутриклеточному выживанию Mtb [26].
Таким образом, вышеизложенное позволяет думать о том, что рано при фагоцитировании начинается адаптация Mtb к внутриклеточному существованию, а именно: переход на анаэробное дыхание, переключение метаболизма на использование жирных кислот как высокоэнергоемких субстратов, а также модернизация клеточной оболочки, что при окислении фагосомы в любом случае означает повышение продукции липидов внешней оболочки. Можно думать также о том, что адаптация эта не спонтанна, а индуцирована макрофагом.
Бациллы в макрофагах были найдены вне фагосом спустя 4-5 дней после инфекции, но представление микобактериального антигена инфицированными макрофагами CD8+ T-клеткам уже может встречаться через 12 часов после инфекции [25]. Микобактериальная вакуоль находится в пределах периферического эндосомального компартемента, доступного для пути сортировки/рециркуляции и может служить платформой сортировки, которая облегчает секрецию и поставку бактериальных элементов к различным компартементам. Освобожденные липидные элементы от микобактериальной оболочки движутся активно из бактериальной вакуоли и поступают в эндоцитарную сеть макрофагов в виде липидных капелек или пузырьков или экзосом, которые проникали через сеть Гольджи, где МНС класса II-процессинга путь предоставляет микобактериальным компонентам дорогу от бактериальных фагосом до поверхности клетки. Выпущенные экзосомы могут служить транспортным средством поставки бактериальных молекул [2]. Таким образом, Mtb липиды повышенно продуцируются внутриклеточными бациллами, эти липиды объединяются во внутренних пузырьках в мультивезикулярном тельце и впоследствии экзоцитируются во внеклеточную среду [27]. Эти экзосомы впоследствии фагоцитируются неинфицированными макрофагами [2]. В данном случае также не вызывает сомнения инициация этого процесса организмом хозяина, а не пассивной, хотя и адаптированной, Mtb.
Самый биоактивный компонент выпущенных липидов из инфицированных клеток был трегалозы димиколат (TDM) [27]. Бактериальные липиды были экспонированы на поверхности экзосомального пузырька [2]. Макрофагов индуцибельный С-типа лектин (Mincle) является необходимым рецептором для TDM [26], который опосредует, очевидно, фагоцитоз экзосом неинфицированными макрофагами, способствуя формированию пенистых макрофагов. Формирование пенистой клетки также было специфически вызвано окисленными формами миколовой кислоты, такими как окси-кетомиколовая и гидрокси-миколовая кислоты, которые синтезируются Mtb [27].
Миколовую кислоту содержащие гликолипиды сохраняются в макрофагах в течение долгого времени, так как необычные длинной цепи жирные кислоты, как миколовые кислоты, устойчивы к перевариванию лизосомальными ферментами [16]. TDM является необходимым компонентом, который позволяет выживание Mtb в пределах клеток хозяина, несмотря на то, что они всего лишь присутствуют в позвоночных [14]. Отмечено, что образующие ленты Mtb сохранялись дольше в культивируемых макрофагах [15]. Так как образование лент ассоциируется с фактором жгутообразования – TDM, то можно думать о том, что чем больше Mtb продуцирует TDM, тем дольше персистирует в клетках хозяина.
После захвата и фагоцитирования Mtb инфицированные альвеолярные макрофаги и DC транспортируют Mtb к средостенным лимфатическим узлам, где Т-клетки примируются и клонально расширяются, начиная адаптивный иммунный ответ [1, 5]. Однако макрофаги и DC не способны к убийству внутриклеточных бактерий и служат лишь бассейном Mtb [1]. Наблюдается отсрочка начала адаптивных реакций, во время которой устанавливается защищенная ниша, в которой бактерии могут персистировать перманентно. Уменьшение МНС класса II экспрессии в антигенпредставляющих клетках легкого во время инфекции ограничено главным образом или исключительно клетками, которые непосредственно инфицированы Mtb. Эффективный процессинг антигена прекращается прежде, чем Mtb начнет продуцировать антиген. Т-клеточные реакции на несекретируемые белки Mtb вообще отсутствовали. Есть серьезные основания полагать, что на все известные главные пути представления антигена влияет Mtb [1], всего лишь присутствуя в организме.
ESX-1 функционирует рано во время инфекции и активируется при фагосомном окислении [24]. ESAT-6 рано секретируется после инфекции и доминирует как цель Т-клеточных реакций [1]. Происходит Т-клеточное узнавание ESAT-6 секреции [7, 8]. ESAT-6 и CFP-10 – главные Т-клеточные антигены [8]. Ag85 также рано секретируется после инфицирования и является целью Т-клеточных реакций [1]. Она образует комплексы с иммуноглобулинами и инактивируется [3].
Отмечено, что родственная Mtb микобактерия маринум в состоянии выйти из содержащей ее вакуоли в цитозоль клетки хозяина и ESX-1 играет существенную роль в этом выходе [30]. Отмечено также, что ESAT-6 и его шаперон CFP-10 имели мембрану разрушающие свойства [1] и Mtb могла вызвать лизис плазменных мембран клеток хозяина [30]. Mtb в макрофагах обнаруживались вне фагосом [25]. Хотя большинство Mtb находится в несплавленных вакуолях, 20-30% Mtb движется глубже в эндосомальный/лизосомальный континуум и, несмотря на это, выживает и даже растет в более враждебном окружении [26].
Все вместе позволяет думать о том, что, помимо адаптивных реакций, Mtb делает попытку уйти от неблагоприятных средовых условий, чему препятствует целевая Т-клеточная реакция. Одна из защитных адаптивных реакций Mtb – увеличение продукции липидов внешней поверхности оболочки. Но организм хозяина связывает секретируемую в повышенных количествах Ag85, тем самым как бы заставляя Mtb непрерывно продуцировать эти липиды. Замечено, что Mtb при попадании в макрофаг могут продуцировать не TDM, а глюкозы мономиколат (GMM) [14]. Это можно было бы объяснить тем, как выше было сказано, что Mtb синтезирует миномиколат, который выпускается из клетки и только внеклеточно конвертируется с помощью Ag85 в димиколат. А так как Ag85 связывается антителами, Mtb продуцирует мономиколат в виде GMM. Трегалоза заменяется на глюкозу, очевидно, по причине ограничения доступности углеводов в среде вакуоли.
Складывается впечатление, что стимуляция продукции липидов внешней клеточной оболочки Mtb и антительное связывание Ag85 – это не спонтанное, а скоординированное действие с целью получения увеличенного количества миколовых кислот содержащих соединений.
Появление Mtb-специфических лимфоцитов через 2-3 недели после инфицирования отмечает конец фазы быстрой бактериальной репликации и начало «сдерживания распространения болезни», состояния, которое характеризуется относительно стабильными бактериальными количествами [28]. В пределах 2-6 недель развивается клеточный иммунитет, приток лимфоцитов и активированных макрофагов ведет к формированию гранулемы [25]. Макрофаги дифференцируются в несколько различных морфотипов, включая многоядерные гигантские клетки, эпителиоидные клетки и пенистые макрофаги, загруженные капельками липида [27]. Классические туберкулоидные гранулемы состоят из очага инфицированных макрофагов, окруженных слоем активированных гигантских клеток и эпителиоидных макрофагов, с мантией лимфоцитов и фиброзом по периферии [9]. В большинстве случаев (до 90% инфицированных людей) высоко активированные макрофаги окружают казеозный центр [12]. В зрелых гранулемах дендритные клетки, показывающие длинные филоподии, замечены вкраплениями среди эпителиоидных клеток [25]. Фиброзная манжета начинает формироваться вне богатого макрофагами слоя, и большинство лимфоцитов исключено из центра гранулемы и скапливается вне фиброзной манжеты [27].
На ранних стадиях развития гранулемы структура становится высоко васкуляризированной через сильную сосудистым эндотелиальным фактором роста-опосредованную реакцию [27]. Поразительными особенностями было заметное рекрутирование нейтрофилов, сопровождаемое адгезией и образованием новых сосудов [9]. Гранулема активно васкуляризируется [28]. Кровеносные сосуды показывают образование обширных скоплений вокруг сосудов и рекрутирование лимфоцитов, макрофагов и DCs к участку инфекции [27].
В пределах гранулемы апоптоз является заметным в эпителиоидных клетках. Мертвые макрофаги формируют казеум. Бациллы содержатся в казеозном центре гранулем [25]. В центральных фокусах некроза наблюдались Mtb, связанные с капельками липида [27]. Жизнеспособные внеклеточные бациллы сохраняются в казеозных поражениях, не будучи метаболически активными или только ограничивали метаболическую активность [12]. Пролиферация же Mtb in situ встречается в макрофагах и в производных макрофага клетках в гранулеме [25]. Пенистые клетки были преобладающим типом клеток, которые сохраняли Mtb. Стабильные непрогрессирующие туберкулезные поражения названы туберкуломами и в этом уравновешенном, динамическом состоянии являются «устойчивой единицей» инфекции и у большинства людей эти гранулемы не развиваются в активные зоны и могут фактически разрешаться [27]. Полагают, что гранулематозные изменения являются не патологическими реакциями, а результатом увеличенных физиологических реакций в органе, так как не наблюдалось дегенеративных изменений в гранулемах или в паренхиме органов, и изменения были транзиторны [16].
Баланс между сдерживанием распространения болезни и прогрессией болезни является сложным и очень динамичным [28]. Хотя инфицированные Mtb макрофаги уменьшены в их способности представлять антигены CD4+ T-клеткам [25], Mtb фактически стимулирует развитие сильного системного иммунного ответа, который модифицируется на локальном тканевом уровне, чтобы облегчить длительное выживание Mtb [20].
У множества бактериальных липидов есть широкие иммуномодулирующие способности, которые влияют на формирование гранулем [9]. Гистологические изменения могут быть вызваны химически определенными и гомогенными миколовую кислоту содержащими гликолипидами. Гликолипиды с более короткой цепи (около С30) миколовыми кислотами не показывают гранулемогенной активности [16]. Один только TDM резко вызывал формирование гранулемы [14]. TDM вызывал продукцию ФНО как мощного хемоаттрактантного фактора для воспалительных клеток [14] и вызывал самую большую секрецию IL-1 и IL-6 [9]. IL-6, как известно, супрессирует Т-клеточные и макрофагов реакции в микросреде гранулемы [9]. Гранулемы содержат CD4+ и CD8+ Т-клетки, которые сдерживают инфекцию в пределах гранулемы [25], активируя локальные макрофаги, которые захватывают и разрушают бациллы, которые покидают край казеума [12]. Полимофноядерные нейтрофилы, накопленные в Mtb инфицированных участках, не имеют никакого очевидного эффекта на рост Mtb [5]. Активированные воспалительные клетки окружают Mtb, предотвращая распространение и передачу патогена. Однако структура гранулемы изолирует жизнеспособные бациллы в среде, отдаленной от макрофаг-активирующих Т-клеток, таким образом проявляя защиту бацилл от элиминации [9]. В гранулематозных поражениях также присутствовал TGF-бета, который продуцируется моноцитами после стимуляции Mtb или LAM и имеет важные противовоспалительные эффекты [25].
Таким образом, инфекция Mtb вызывает в организме сложную реакцию, когда, с одной стороны, при интактной иммунной системе, организм захватывает и фагоцитирует Mtb, но не убивает, а создает специфические условия, при которых Mtb остаются жизнеспособными, но вынуждены продуцировать повышенные количества миколовых кислот содержащих соединений. Такие Mtb помещаются в специально создаваемые структуры – гранулемы, где они находятся под защитой и контролем репликации. Если же Mtb покидают пределы гранулемы, они уничтожаются окружающими гранулему воспалительными клетками.
Гранулемы предлагают чрезвычайно разнообразный диапазон сред для Mtb. Внутренние области полностью стратифицированной гранулемы имеют чрезвычайно низкий, но поддающийся обнаружению кислородный потенциал [28]. В клетках, окружающих казеум, обнаружено непропорциональное изобилие белков, вовлеченных в липидный метаболизм. Здесь повышенно экспрессируются гены для липидной секвестрации и метаболизма, а именно адипофилин (ADFP), ацил-Co-A синтазы длинной цепи семейства член 1 (ACSL1) и пресаподин (PSAP). Уровни ADFP увеличиваются чрезмерными длинноцепочечными жирными кислотами, ограничением пищи, модифицированными липопротеидами низкой плотности (ЛПНП) или факторами транскрипции, играющими роль в липидном метаболизме. Он был обнаружен в клетках, противолежащих казеуму в гранулемах. Он присутствует на поверхности и ядре внутриклеточных капелек липида, сформированных в пенистых клетках. ACSL1 опосредует формирование жирных кислот-CoA сложных эфиров из жирных кислот и также найден связанным с капельками липида. SapC помогает деградации гликосфинголипидов в церамид и сфингозин в кислых компартементах. Также в гранулемах увеличивалась экспрессия бета-галактозидазы и бета-глюкозидазы 20 и 32-кратно соответственно [20]. То есть гранулемы не просто сохраняют Mtb, а в них происходит интенсивный липидный обмен.
Пенистые макрофаги были расположены главным образом в области внутренней поверхности, непосредственно примыкающей к центральному некрозу. Макрофаги конвертируются в пенистые клетки через дисрегуляцию критического положения между притоком и истоком из сыворотки ЛПНП частиц, которые содержат холестерин, TAG и фосфолипиды. Холестерин после распада ЛПНП импортируется в цитозоль клетки и сохранен макрофагом, а большинство фосфолипидов и TAG метаболизируется [27].
Анализ липидов в казеуме гранулемы показал главные виды липидов, как холестерин, сложные эфиры холестерина и TAG, которые полностью совместимы с липидами, происходящими из капелек липида [27], и этот профиль липидного обогащения наиболее совместим с липидами, прибывающими из липидных капелек, сформированных в макрофагах, которые приобрели эти липиды от ЛПНП [20]. Известно, что пенистые макрофаги поддерживают внутриклеточные Mtb в физиологическом состоянии. Mtb могут получать доступ к этим структурам как к источнику питания. Другие инфекции также могут вести к формированию пенистых макрофагов (хламидийная инфекция) и это было связано с пищевыми потребностями патогена. Mtb могут сохраняться в пределах человеческих адипоцитов, другого богатого липидами типа клеток [27].
Таким образом, можно думать о том, что пенистые макрофаги являются транспортным средством, снабжающим гранулемы и находящиеся в них Mtb липидами. Можно предположить, что в гранулемах эти липиды подвергаются сортировке с последующим употреблением части жирных кислот для синтеза миколовых кислот содержащих соединений, части – для получения энергии при анаэробном метаболизме, а остальное откладывается в казеуме.
Как выше было сказано, гомогенная популяция экзосом, содержащих микобактериальные липиды, идентифицирована во внеклеточной среде инфицированных макрофагов, и эти экзосомы фагоцитируются неинфицированными макрофагами. Бактериальные липиды экспонируются на поверхности экзосом [2]. Преобладающим липидом Mtb оболочки является TDM. Макрофагальный рецептор с коллагеновой структурой (MARCO), класса А скавенджер-рецептор, используется, чтобы «привязать» TDM к макрофагу и активировать TLR2 путь, что инициирует мощную провоспалительную реакцию. Но один MARCO не достаточен для связи TDM, взаимодействие TDM-рецептор имеет низкую авидность и требует помощи ко-рецептора или других добавочных молекул [4]. Макрофагов индуцибельный С-типа лектин (Mincle) является необходимым рецептором для TDM [14].
Индуцированный Mtb липидами высокий уровень IL-6 ингибирует реакцию неинфицированных макрофагов на интерферон-гамма и подавляет провоспалительную реакцию. При введении в культуру бусинок, покрытых трегалозы миколатами, макрофаги проявляли секрецию ФНО-альфа. Причем бусинки диаметром 1 мкм не индуцировали ФНО, диаметром 10 мкм выявляли некоторый ФНО, но секреция была максимальна при диаметре бусинок 25 и особенно 90 мкм, к которым макрофаги адгезировали [9].
Таким образом, можно думать о том, что неинфицированные макрофаги целенаправленно фагоцитируют экзосомы, содержащие на своей поверхности миколаты, причем настроены на адгезию к экзосомам, а не к Mtb, так как распознают бусинки, намного крупнее Mtb, а также реагируют на миколаты, тогда как альвеолярные макрофаги реагируют на LAM.
Все вместе позволяет предположить, что при Mtb инфекции существует три типа макрофагов. Одни макрофаги содержат Mtb и экзоцитируют миколаты. Другие захватывают липиды ЛПНП и транспортируют их к первому типу, снабжая ими Mtb. И третий тип, который фагоцитирует экзосомы с миколатами и, очевидно, является их транспортером, так как миколаты не перевариваются в лизосомах макрофагов.
В меньшинстве случаев (до 10% инфицированных людей) твердый казеум размягчается, из-за чего инфекция Mtb прогрессирует в болезнь туберкулез [12, 20, 27]. Резкое увеличение и разжижение казеума возможно лишь при увеличении притока жидкости внутрь гранулемы, что, как думают, следует из-за массированной смерти макрофагов в результате некроза [20, 27]. В пределах казеозного поражения случается критический феномен – смерть большинства, если не всех Mtb. Поразительный контраст наблюдается между высоким бактериальным содержанием поражений, в которых процесс створаживания начинается, и ограниченным числом или отсутствием жизнеспособных бацилл в старых казеозных фокусах. После прорыва в бронхи высокое содержание О2 способствует интенсивному размножению Mtb – бациллы впервые в течение болезни свободно размножаются внеклеточно. Но если размягченное казеозное поражение не открыто для бронхов, увеличения Mtb не наблюдается [12].
Все вместе позволяет думать о том, что проявление болезни происходит при гибели как макрофагов, так и Mtb, с прорывом в бронхи. Складывается впечатление, что прогресс инфекции Mtb в болезнь выглядит как попытка организма освободиться как от инфекции Mtb, так и от структур, способствующих ее персистенции.
Считается, что одна треть населения в мире содержит бактерии Mtb, то есть она существует в клетках хозяина и является латентной инфекцией туберкулеза: бессимптомным состоянием без клинического или радиологического признака активной болезни, но с жизнеспособными организмами Mtb в пределах тканей [5, 18, 27]. Они персистируют перманентно в теле, несмотря на интактную иммунную систему [1]. Причем системный иммунный ответ сопоставим у людей, развивающих болезнь, и у людей с эффективным сдерживанием распространения болезни [27]. То есть можно думать, что развитие инфекции в болезнь совершенно не зависит от состояния иммунной системы.
Маловероятно, что вся эта одна треть населения контактировала с туберкулезными больными. Но даже если единственное каплеобразное ядро могло быть достаточно, чтобы вызвать инфекцию у людей,хорошо установлено, что люди, которые длительно экспонированы мазок-положительными (то есть выделяющими бациллы) близкими пациентами (домашние контакты) и кто вдыхал многочисленные каплеобразные ядра, не всегда преобразовывают это в положительность кожной пробы туберкулина [12]. То есть у существенной пропорции (до 50%) тесных контактов с микробиологически подтвержденными случаями нет никаких иммунодиагностических признаков ТВ. Тот же самый феномен зарегистрирован у неоднократно подвергаемых воздействию служащих здравоохранения, работающих в стационарных палатах ТВ [5].
Известно, что существует маннон (или манноз)-связывающий лектин (MBL), который является плазменным белком врожденной иммунной обороны, связывается со специфическими повторяющимися структурами углеводов на микробных поверхностях и активирует каскад комплемента через MBL-связанные сериновые протеазы (MASP) – так называемый MBL путь активации комплемента. Белки сурфактанта SP-A и SP-D, а также коллектины, являются легочными копиями MBL [11]. Белок SP-D связывает LAM на поверхности Mtb, маскирует его и направляет фагоцитоз через альтернативные пути, вызывая созревание фагосом [6]. Это могло бы объяснить повышенную заболеваемость туберкулезом среди лиц с хроническими легочными заболеваниями, сопровождаемыми, как известно, нарушениями сурфактанта.
Известен другой белок – витамин D-связывающий протеин (DBP) – многофункциональный белок, который конститутивно продуцируется печенью, служит белком-носителем вит D, включая 1,25(ОН)2D3, к клеткам, действуя как нейтрализатор актина с последующей активацией макрофагов [11]. Известно также, что созревание фагосом наблюдается после предварительной обработки вит D перед экспозицией [13]. Эстрогены увеличивали уровень DBP [11]. Очевидно, это могло бы объяснить сниженную заболеваемость среди женщин по сравнению с мужчинами – повышенный уровень DBP мог бы препятствовать инфицированию Mtb.
Известно, что заболеваемость туберкулезом выше у людей, имеющих дефицит питания или явно голодающих. Можно думать о том, что при дефиците питания, особенно липидов, снабжение липидами ЛПНП находящихся в центре гранулемы Mtb нарушается, что могло бы быть причиной их массовой гибели с последующим некрозом центра гранулемы и ее разрывом, что вело бы к прогрессу болезни.
Итак, на основании всего вышеизложенного можно предположить, что инфицируемый организм не пассивный участник процесса, а активно и целенаправленно захватывает совершенно пассивную Mtb, создает ей условия для выживания, стимулируя при это продукцию большого количества миколовых кислот содержащих соединений, для чего создает специфические структуры – гранулемы, обеспечивая защиту Mtb, в то же время контролируя нахождение Mtb только внутри гранулемы. В гранулемах Mtb обеспечивается поставкой липидов для питания и продуцирования миколатов, которые, в свою очередь, загружаются и транспортируются макрофагами. Все это похоже на сложный технологический процесс – своего рода «фабрику» по производству миколатов.
Известно, что гранулемы – это не исключительное свойство инфекции. Совершенно аналогичные гранулемы формируются при саркоидозе, только без казеозного центра. Было высказано предположение, что гранулемы при саркоидозе являются специфической структурой лимфоидной ткани, создаваемой для собственных нужд, в случае саркоидоза для примирования легочных макрофагов (см. «О саркоидозе»).
Показано, что гликолипиды с миколовой кислотой индуцировали кроветворение в печени и селезенке. Наблюдались многочисленные мелкие кроветворные островки в печени: различные типы незрелых клеток крови формировали гомогенные скопления клеток в синусоидах, улавливаемые цитоплазматическими отростками клеток Купфера, или прилегающими к эндотелиальным клеткам, переносили там пролиферацию и дифференцирование и постепенно мигрировали из синусоид. Увеличенная продукция клеток крови также встречалась в селезенке. Гликолипиды действовали как биологической реакции модификаторы (BRMs). Полагают, что формирование гранулемы и печеночное кроветворение представляют морфологическую экспрессию макрофагальной активации [16]. Полагают также, что гликолипиды стимулируют выпуск серологических колониестимулирующих факторов, индуцирующих увеличение гематопоэтической активности [16, 19]. Возможно, лимфоидная ткань могла бы использовать Mtb для своих нужд (в данном случае для дополнительного стимулирования гемопоэза), подобно тому, как она, как предполагалось, использует Helicobacter pylori (см. «О язвенной болезни»).
Литература:
1. Baena A, Porcelli SA. Tissue Antigens 2009, Sep; 74(3):189-204
2. Beatty WL, Rhoades ER, Ullrich H-J, Chatterjee D, Heuser JE, Russell DG. Traffic 2000 1: 235-247
3. Bentley-Hibbert SI, Quan X, Newman T, Huygen K, Godfrey HP. Infect Immun 1999 Feb; 67(2): 581-588
4. Bowdish DME, Sakamoto K, Kim M-J, Kroos M, Mukhopadhyay S, Leifer CA, Tryggvason K, Gordon S, Russell DG. PLoS Pathog. 2009 June; 5(6): e1000474
5. Dheda K, Schwander SK , Zhu B, Van Zyl-Smit RN, Zhang Y. Respirology 2010, Apr, Vol 15, Issue 3, 433-450
6. Ferguson JS, Martin JL, Azad AK, McCarthy TR, Kang PB, Voelker DR, Crouch EC, Schlesinger LS. Infect Immun 2006 Dec; 74(12): 7005-7009
7. Ferrer NL, Gomez AB , Neyrolles O, Gicquel B, Martin C. PLoS One 2010; 5(9): e12978
8. Frigui W, Bottai D, Majlessi L, Monot M, Josselin E, Brodin P, Garnier T, Gicquel B, Martin C, Leclere C, Cole ST, Brosch R. PLoS Pathog. 2008 Feb; 4(2): e33
9. Geisel RE, Sakamoto K, Russell DG, Rhoades ER. The Journal of Immunology 2005, 174: 5007-5015
10. Gonzalo-Asensio J, Mostowy S, Harders-Westerveen J, Huygen K, Hernandez-Pando R, Thole J, Behr M, Gicquel B, Martin C. PLoS One 2008; 3(10): e3496
11. Gravholt CH, Leth-Larsen R, Lauridsen AL, Thiel S, Hansen TK, Holmskov U, Naeraa RW, Christiansen JS. European Journal of Endocrinology 2004 150 355-362
12. Grosset J. Antimicrob Agents Chemother 2003 Mar; 47(3): 833-836
13. Hmama Z, Sendide K, Talal A, Garcia R, Dobos K, Reiner NE. Journal of Cell Science 2004, 117, 2131-2140
14. Ishikawa E, Ishikawa T, Morita YS, Toyonaga K, Yamada H, Takeuchi O, Kinoshita T, Akira S, Yoshikai Y, Yamasaki S. J Exp Mad 2009 Dec 21; 206(13): 2879-2888
15. Julian E, Roldan M, Sanchez-Chardi A, Astola O, Agusti G, Luquin M. J Bacteriol 2010 Apr; 192(7): 1751-1760
16. Kaneda K, Sumi Y, Kurano F, Kato Y, Yano I. Infection and Immunity 1986, Dec, 869-204
17. Kang PB, Azad AK, Torrelles JB, Kaufman TM, Baharka A, Tibesar E, DesJardin LE, Schlesinger LS. J Exp Med 2005 Oct 3; 202(7): 087-999
18. Katsube T, Matsumoto S, Takatsuka M, Okuyama M, Ozeki Y, Naito M, Nishiuchi Y, Fujiwara N, Yoshimura M, Tsuboi T, Torii M, Oshitani N, Arakawa T, Kobayashi K. J Bacteriol 2007 Nov; 189(22): 8241-8249
19. Kaur S, Kaur H, Singh PP. Eur Cytokine Netw 2004 Oct-Dec; 15(4): 327-38
20. Kim M-J, Wainwright HC, Locketz M, Bekker L-G, Walther GB, Dittrich C, Visser A, Wang W, Hsu F-F, Wiehart U, Tsenova L, Kaplan G, Russell DG. EMBO Mol Med 2010 July; 2(7): 258-274
21. Kusner DJ, Barton JA. The Journal of Immunology 2001, 167: 3308-3315
22. Li AH, Waddell SJ, Hinds J, Malloff CA, Bains M, Hadcock RE, Lam WL, Butcher PD, Stokes RW. PLoS One 2010; 5(6): e11066
23. Malik ZA, Thompson CR, Hashimi S, Porter B, Iyer SS, Kusner DJ. The Journal of Immunology 2003, 170: 2811-2815
24. Raghavan S, Manzanillo P, Chan K, Dovey C, Cox JS. Natur 2008 Aug 7; 454(7205): 717-721
25. Raja A. Indian J Med Res 2004, Oct, 120, 213-232
26. Rohde KH, Abramovitch RB, Russell DG. Cell Host and Microbe 2007 Nov 15, Vol 2, Issue 5, 352-364
27. Russell DG, Cardona P-J, Kim M-J, Allain S, Altare F. Nat Immunol 2009 Sep; 10(9): 943-948
28. Russell DG, Barry CE, Flynn JL. Science 2010 May 14; 328(5980): 852-854
29. Shiloh MU, DiGiuseppo Champion A. Curr Opin Microbiol 2010 Feb; 13(1): 86-92
30. Smith J, Manoranjan J, Pan M, Bohsali A, Xu J, Liu J, McDonald KL, Szyk A, LaRonde-LeBlanc N, Gao L-Y. Infect Immun 2008 Dec; 76(12): 5478-5487
31. Takayama K, Wang C, Besra GS. Clin Microbiol Rev 2005 Jan; 18(1): 81-101
32. Zimmerli S, Majeed M, Gustavsson M, Stendahl O, Sanan DA, Ernst JD. The Journal of Cell Biology 1996, Jan, No 102, Vol 132, 49-61
