Дмитрий Марфунин

"Об остром лимфобластном лейкозе"

На главную

15 декабря 2017 года

 

Как известно, острый лимфобластный лейкоз (acute lymphoblastic leukemia (ALL)) – это злокачественное заболевание системы кроветворения, характеризующееся неконтролируемой пролиферацией незрелых лимфоидных клеток (лимфобластов). ALL – самый общий педиатрический рак, объясняя 30% всех педиатрических злокачественных развитий [29]. Частота ALL в различных странах – 2-5 случаев на 100000 человек в год [30]. До 85% случаев ALL детства имеют В-клеточное происхождение (B-ALL) [6] (у взрослых – до 75%  [9, 32]). В большинстве случаев ALL проявляется как злокачественная опухоль de novo у ранее здоровых людей [32].
Пик заболеваемости B-ALL приходится примерно на трехлетний возраст, что совпадает по времени с максимальной активностью производства В-клеток в костном мозге. Второй, более низкий, пик заболеваемости приходится на возраст старше 60 лет. Критическим периодом в случае T-ALL является возраст около 15 лет, примерно в это же время тимус достигает максимального размера (Википедия).
Общие известные механизмы, лежащие в основе индукции ALL, включают хромосомную транслокацию, гипердиплоидность и аберрантную экспрессию протоонкогенов [2]. У ALL геномов есть более низкое бремя генетических альтераций, чем у многих солидных опухолей, с фокальным стиранием, являющимся признаком лимфоидного лейкоза. В большинстве случаев это стирание в ключевых факторах транскрипции, вовлеченных в В-клеточное развитие. Наиболее распространены перестановки, вовлекающие ABL1 (этот ген представляет собой протоонкоген, который кодирует белковую тирозинкиназу, участвующую в различных критических процессах, включая деление клетки, адгезию, дифференцировку и ответ на стресс), а также ABL2, цитокин рецептор-подобный фактор 2 (CRLF2), колониестимулирующего фактора 1 рецептор (CSF1R), эритропоэтина рецептор (EROR), janus киназу 2 (JAK2), нейтрофильной тирозинкиназы рецептора тип 3 (NTRK3), тромбоцитарного происхождения фактора роста рецептор бета (PDGFRbeta), протеин тирозинкиназу 2бета, тимусный стромальный лимфопоэтин (TSLP), тирозин киназу 2 и мутации последовательности, вовлекающие fms-связанную тирозинкиназу 3 (FLT3), интерлейкина 7 рецептор или SH2B3 [16].
Стандартные генетические исследования могут идентифицировать специфические генетические аномалии только приблизительно в 75-80% детства ALL случаев. Эти исследования не могут идентифицировать полный репертуар генетических альтераций [27].
Большинство случаев B-ALL являются анэуплоидными или показывают рецидивирующие хромосомные перестановки, которые являются важными событиями введения в лейкемогенез. Эти перестановки обычно пертурбируют гены, кодирующие регуляторы гематопоэза, супрессоры опухоли, онкогены или тирозин киназы. Самая общая перестановка в B-ALL – t(12;21)(p13;q22), которая кодирует ETV6-RUNX1 [21]. (ETV – фактор транскрипции, участвующий в кроветворении и поддержании развитой сосудистой сети; RUNX1 – фактор транскрипции, участвующий в нормальном гемопоэзе). И ETV6 и RUNX1 требуются для нормального окончательного гематопоэза. Альтернативное сращивание приводит к вариантам нескольких  транскриптов. ETV6-RUNX1 вызывает сверхэкспрессию рецептора эритропоэтина (EROR). ETV6-RUNX1 вызывает самовозобновление в В-клетках-прародителях [21].
Но большинства известных крупномасштабных генетических аберраций ALL недостаточно, чтобы вызвать болезнь и чтобы объяснить биологию и гетерогенность болезни [21, 22]. Так, ETV6-RUNX1 является недостаточным, чтобы вызвать лейкозную трансформацию в человеческих гематопоэтических стволовых или прародителя клетках [5]. ETV6-RUNX1 обнаруживается обычно при рождении, за годы до начала лейкоза, предполагая, что вторичные генетические события обязаны вызвать лейкоз [21]. Частота ETV6-RUNX1 в здоровых младенцах далеко превышает уровень ALL, предполагая, что у нормальных людей могут быть В клетки, имеющие ETV6-RUNX1 слияние, которые никогда не переносят полную лейкозную трансформацию [5].
Многие из одних только этих альтераций не вызывают лейкемию. Рецидивирующие хромосомные альтерации отсутствуют почти в 20% случаев [15]. Мутации, вызывающие ALL с высокой пенетрантностью, пока не обнаружены. Совместные мутации необходимы для злокачественной трансформации и прогрессии [27]. Существующие данные показывают, что несколько генов изменены многочисленными механизмами, включая стирание или усиление, мутацию последовательности и транслокацию [15]. В среднем 6,4 геномных поражений присутствует на случай [6].
Инактивация генов супрессоров опухоли – центральный путь лейкемогенеза ALL [31]. Идентифицированы многие критические новые цели мутации в B-ALL, которые часто вовлекают гены, которые регулируют лимфоидное развитие, клеточный цикл, супрессию опухоли и множество других ключевых клеточных путей [21].
Стирания больше являются распространенными, чем усиление, и типично являются фокальными, часто вовлекая только единственный ген [15]. Структурные альтерации генов, кодирующих транскрипционные регуляторы В-клеточного развития и дифференцирования, встречаются более чем у 40% пациентов в B-ALL [6, 21].
Все эти многочисленные разнообразные геномные изменения, наблюдаемые при развитии ALL, не могли быть спонтанными, случайными. Складывается впечатление, что это целенаправленный процесс, приводящий, в конечном счете, к неконтролируемой пролиферации лимфобластов. Тем более что клеточный состав ALL не моноклонный. Исследования подтверждают клональную гетерогенность в большинстве случаев ALL во время диагноза [21]. Состав клеток лейкоза был поликлонным и подобным составу селезенки или костного мозга [13].
ALL геномы не являются статичными, часто приобретая вторичные кариотипные и генетические альтерации во время болезни [21]. Большинство ALL случаев показывают существенные изменения в природе генетических альтераций во время курса болезни, и рецидив часто является результатом появления незначительного субклона с генетическими альтерациями, отличными от таковых из преобладающего клона при диагнозе [6, 15].
Рецидив, как правило, наступает после ремиссии, наступившей, в свою очередь, после курса химиотерапии. Если после химиотерапии лейкозные лимфоциты претерпевают аутомодификацию, приводящую к устойчивости к химиотерапии, то можно думать о том, что и первичные изменения, приводящие к лейкозной трансформации, тоже могли бы быть результатом аутомодификации.
Большинства текущих генетических событий, наблюдаемых в лейкозах, недостаточно, чтобы полностью преобразовать нормального гематопоэтического прародителя. Во время злокачественной трансформации клетка может обратиться (!) и к генетическим и к эпигенетическим механизмам, чтобы гарантировать дерегуляцию ключевых биологических путей, которые поддержали бы расширение злокачественного клона [10]. Аберрантное эпигенетическое регулирование встречается универсально [12]. Аномальное метилирование промотора нескольких генов распространено у больных с ALL. Метилирование ДНК вызвано ДНК метилтрансферазами (DNMT). Экспрессия DNMT увеличена при лейкозе [34]. Метилирование в промоторной области – частый приобретенный эпигенетический случай, вовлеченный в патогенез многих видов человеческих злокачественных развитий, включая лейкоз. ДНК метилирование на участках CpG в промоторной области может вызвать генные глушения, которые могут объяснить дополнительный путь генной инактивации в дополнение к их стиранию или мутациям [31]. Подобно нормальным тканям, опухоли могут зависеть от специфической картины ДНК метилирования, чтобы приобрести свои уникальные фенотипы [12]. Изменения в ДНК метилирования картине ALL могут играть важную роль в определении транскрипционной программы и поэтому фенотипа лейкозных бластов [10].
Гиперметилирование способствует ранним шагам лейкемогенеза [31]. Гиперметилирование одной аллели может позволить экспрессию только одной из аллелей гена [22]. По сравнению с нормальными пре-В-клетками, большинство генных промоторов было дифференцированно метилировано, гипометилировано во всех подтипах B-ALL. Однако, что было поразительно очевидно, что каждый подтип B-ALL показал уникальную картину цитозина метилирования и генной экспрессии [8]. Различные ALL подгруппы показывают различные профили метилирования [21].
Вовлеченные гены являются ключевыми регуляторами развития клетки крови, пролиферации и дифференцирования [15]. Аберрантное промотора метилирование было связано с измененной экспрессией генов, вовлеченных в транскрипционное регулирование, процессы клеточного цикла, активацию лимфоцита, пролиферацию и апоптоз [2].
Аберрантного ДНК метилирования картины, наблюдаемые в злокачественных развитиях, не могут интерпретироваться как простые вторичные события, пассивно приобретенные во время трансформации, а скорее должны играть активную роль в определении злокачественного фенотипа [10]. Несколько генов, которые были метилированы при начальном представлении, потеряли свое метилирование при рецидиве [31]. ДНК метилирования картины являются эпигенетически сохранными во время деления клетки, обеспечивая механизм для наследования транскрипционных программ, важных для спецификации ткани [7, 12].
В то время как лейкоз возникает в костном мозге, это – системная болезнь со склонностью для определенных органов, таких как ЦНС [13]. ЦНС тропизм является вездесущей особенностью в ALL  бластах. Предположено, что ЦНС инфильтрация была универсальной особенностью лейкозных бластов [3].
Участие ЦНС во время диагностики обнаруживается у 5-8% пациентов [33]. По другим данным, у 15% детей есть морфологические признаки лейкоза ЦНС во время диагноза [13]. У взрослых пациентов со зрелым B-ALL есть 18% причастности ЦНС [26]. До появления ЦНС-направленных методов лечения лейкоза ЦНС лейкоз развивался более чем у половины педиатрических пациентов лейкоза. До 50-75% лейкоза развивались у больных до развития адекватных методов лечения лейкоза ЦНС. Более чувствительные экспертизы обнаруживают лейкоз ЦНС у до 40% пациентов при диагнозе [13]. Причастность ЦНС в ALL остается плохо диагностируемой, это подтверждается аутопсийной демонстрацией ЦНС у больных. ЯМР отображение не обеспечивает уверенность об отсутствии скрытой болезни ЦНС в ходе ALL [26].
Диффузная инфильтрация оболочек и субарахноидального пространства лейкозными клетками больше всего распространенная форма причастности ЦНС ALL [1, 13, 17]. Затем клетки лейкоза мигрируют в более глубокие менингиальные ткани, окружающие сосуд в коре (!) и белом веществе [13].
ЦНС  обеспечивает уникальную нишу лейкоза, которая может влиять на биологию лейкоза [11]. Совместные культивации клеток лейкоза с астроцитами, эпителиальными клетками сосудистого сплетения или менингиальными клетками увеличивали устойчивость клеток лейкоза к индуцированной лекарствами клеточной смерти [13].
В поддержку роли для функционального значения ЦНС ниши в лейкозе наблюдаются высокие нормы (50-75%) ЦНС лейкоза. Прямое влияние ниши ЦНС на клетки лейкоза может больше способствовать рецидиву, чем способность клеток мигрировать [11]. Мыши с пересаженными человеческими клетками лейкоза развивали лейкоз ЦНС, несмотря на то, что у доноров не было лейкоза ЦНС [13]. Причастность ЦНС в рецидиве встречается главным образом у больных, у кого не было причастности ЦНС при начальном диагнозе [3].
Уникальная цереброспинальной жидкостью (ЦСЖ) заполненная микросреда субарахноидального пространства генерирована клеточными тканями, включая астроциты, сосудистой оболочки сплетения эпителиальные клетки и менингиальные клетки [1]. ЦСЖ продуцируется в мозге модифицированными эпендимальными клетками в сплетении сосудистой оболочки, которое расположено в желудочках мозга [19, 33]. В отличие от гематоэнцефалического барьера, окончатые эндотелиальные клетки сплетения сосудистой оболочки испытывают недостаток в плотных соединениях, и поэтому этот участок специализирован, чтобы позволить лимфоцитам больше свободного доступа к ЦСЖ. Состав иммунных клеток в крови и в ЦСЖ отличается: при нормальных обстоятельствах ЦСЖ содержит немного врожденных иммунных клеток, но намного более высокий процент памяти или антеген-квалифицированных CD4+ Т-клеток, чем кровь, предполагая, что именно эти клетки специфично вовлечены в иммунное наблюдение [33]. Но клетки лейкоза, как уже было упомянуто, первоначально локализуются на поверхности мозга, а затем мигрируют в более глубокие менингиальные ткани, окружающие сосуды в коре [13]. ALL клетки мигрируют к астроцитам, эпителиальным клеткам и менингиальным клеткам. Документировано физическое взаимодействие ALL клеток с этими тремя ЦНС-производными клеточными типами [1]. То есть лейкозные клетки инфильтрируют мягкие оболочки, покрывающие поверхность коры мозга, несмотря на то, что в желудочках им предоставлено больше свободного доступа. Можно предположить, что в данном случае имеет место быть наличие какого-то стимула, вызывающего эту инфильтрацию.
Адекватные поставки йода и гормонов щитовидной железы необходимы для нормального развития ЦНС. До 80% циркулирующего Т3 произведены активностью селен-содержащего фермента тип I йодтиронина дейодиназы (ID-I). Тип II йодтиронина дейодиназа (ID-II) (также содержащая селен) также конвертирует Т4 в Т3. ID-II активность составляет 80% ядерного Т3 в коре головного мозга и 50% в гипофизе [20].
Селен-содержащий белок селенопротеин Р (SePP) был идентифицирован как возможный транспортер селена. Около 60% селена в плазме присутствует как SePP. Он отличается от других селенопротеинов тем, что содержит до 10 атомов селена в молекуле в отличие от единственного в других селенопротеинах [25].
Селен – необходимый микроэлемент с мозг-специфической физиологией. Селенопротеины играют важные роли в мозговом развитии и метаболизме. Нехватка поставки селена вызывает тяжелые неврологические фенотипы. SePP также экспрессирован в мозговых клетках, и мРНК SePP экспрессирована во всех областях мозга, но прежде всего в мозжечковой коре, гиппокампусе и обонятельной луковице [20]. Целевое разрушение гена SePP ведет к сниженной мозговой концентрации селена и неврологической дисфункции [25].
Мозг более в состоянии сохранить селен и поддержать SePP экспрессию, когда диетические поставки микроэлемента ограничиваются [20]. В ЦНС уровни SePP могут быть поддержаны независимо от плазменного селена [25]. Параллельный дефицит селена усиливает гипотиреоидные эффекты дефицита йода, но эффекты на мозг ограничены активацией компенсаторных механизмов [20]. ЦНС устойчива к колебаниям в селене и может поддерживать устойчивые уровни, несмотря на близкое полное истощение диетического поглощения селена. Мозг поддерживает селен лучше, чем другие ткани при условиях низкого селена. ЦНС демонстрирует приоритет для селена, который выходит за пределы способности к SePP-зависимой поставке селена [25]. Хотя ЦНС не показывает самую большую концентрацию селена в случае достаточной поставки селена, она показывает первоочередность для поглощения селена и задержания селена в случае дефицита селена [19].
Не мозг в целом, но различные мозговые области показывают преимущественное поглощение селена в случае его дефицита [19]. Содержание селена мозга было самым высоким в областях, содержащих обильное серое вещество, и в железистых тканях [19, 28]. Особенно высокие уровни Se в нормальных условиях наблюдались в черной субстанции [28].
ЦСЖ, несмотря на относительно низкую концентрацию селена, показала самое высокое поглощение прикладного селена в мозге. Это можно объяснить только высокой скоростью оборота этого элемента в желудочковой системе, где сплетение сосудистой оболочки играет выдающуюся роль в регулировании гомеостаза этого и других микроэлементов. Плазменный полураспад Se в SePP был 3-4 часа, что указывает на быстрый оборот [19].
Таким образом, селен поступает в мозг через сплетение сосудистой оболочки желудочковой системы, а концентрируется в областях с обильным серым веществом, то есть в коре.
Селен – основная часть фермента глютатион пероксидазы, которая защищает клетки от окислительного повреждения, удаляя потенциально разрушительные гидроперекиси липидов и перекись водорода [4, 24]. Через селенопротеины селен может влиять на 3 широкие области клеточной функции посредством антиоксидантной активности, метаболизма гормонов щитовидной железы и регуляции активности редокс-активных белков [4].
Селен является необходимым для активности фактически всех ветвей иммунной системы. Селен влияет как на врожденную, «неадаптивную», так и на приобретенную «адаптивную» иммунную систему [4]. Нет очевидных иммунных заболеваний, связанных с дефицитом селена [14]. Селен при физиологических концентрациях может эффективно ингибировать пролиферацию групп человеческих лимфоцитов в ответ на различные иммунные стимулы [24]. Селен-дефицитные лимфоциты менее способны пролиферировать в ответ на митогены, а в макрофагах синтез лейкотриена В4 нарушается этим дефицитом. При дефиците селена титры IgG и IgM снижаются у людей [4]. Антипролиферативные эффекты селена могут быть специфическими для определенной лимфоцитарной субпопуляции [24]. Всё вышеизложенное позволяет думать о важности селена в физиологии иммунной системы.
Серологический уровень селена у больных с острым лейкозом главным образом зависит от активности опухоли. Нет никакого значительного различия между серологическим селеном у здоровых детей и детей с ALL до химиотерапии. После достижения полной ремиссии у детей с ALL серологический селен уменьшается, возможно, из-за химиотерапии [24].
Известно, что ЦСЖ субарахноидального пространства имеет отток через пахионовы грануляции в венозные синусы твердой мозговой оболочки. Ранее предположено (см. «О мелатонине») существование пути оттока ЦСЖ и содержащихся в ней продуктов жизнедеятельности коры головного мозга: ЦСЖ – пахионовы грануляции – венозные синусы – эмиссарные вены – подкожное венозное сплетение головы. Учитывая высокую скорость оборота селен-содержащих протеинов, можно думать о том, что селен может поступать вышеописанным путем и захватываться меланоцитами волос, как это происходит с токсинами и тяжелыми металлами.
Известно, что в волосах в норме обнаруживали определенный уровень селена. Но также отмечается, что уровни селена волос у детей с лейкозом были ниже, чем таковые из контроля, однако уровни селена крови и мочи были нормальны [23]. В другом случае уровни и в волосах и в сыворотке детей с раком были значительно ниже, чем таковые из контроля [18]. Так как выше сказано, что при ALL в большинстве случаев отмечается инфильтрация лимфоцитами мягких мозговых оболочек, можно предположить, что эти лимфоциты могли бы захватывать селен как из ЦСЖ, так и при непосредственном контакте с эпителиальными и глиальными клетками. Это могло бы быть причиной снижения содержания селена в волосах больных ALL.
Итак, на основании вышеизложенных фактов и умозаключений можно предположить, что острый лимфобластный лейкоз мог бы быть результатом реакции лимфоидной системы или на снижение поступления селена в организм или на снижение его уровня в лимфоидной ткани или же на увеличение потребности в нем у лимфоидной ткани. Обращает на себя внимание следующий факт: требуется три поколения у крыс, кормившихся селен-дефицитной диетой, чтобы экспрессировать фенотип дефицита селена [19].

ЛИТЕРАТУРА:

1. Akers SM, Rellick SL, Fortney JE, Gibson LF. Leuk Res 2-11 Jun; 35(6): 705-711
2. Almamur M, Levinson BT, Swaay van AC, Johnson NT, McKay SD, Arthur GL, Davis JW, Taylor KN. Epigenetics 2015 Aug; vol 121, Issue 15, p 2517-2528
3. Alsadeq A, Schewe DM. Haematologica 2017 Apr; 102(5); 611-613
4. Arthur JR, McKenzie RC, Beckett GJ. J Nutr. 2003 May 1, vol 133 n 5 1457S-1459S
5. Bernt KM, Armstrong SA. Semin Hematol 2009 Jan; 46(1): 33-38
6. Bhojwani D, Yang JY, Pui C-H. Pediatr Clin North Am 2015 Feb; 62(1): 47-60
7. Chatterton Z, Morenos L, Mechinaud F, Ashley DM, Craig JM, Sexton-Oates A, Halemba MS, Parkinson-Bates M, Ng J, Morrison D, Carroll WL, Saffery R, Wong NC. Epigenetics 2014 Mar 1; 9(3): 459-467
8. Cimmino L, Aifantis I. Cancer Discov 2012 Nov; 2(11): 976-978
9. Coustan-Smith E, Mullighan CG, Onciu M, Behm FG, Raimondi SC, Pei D, Cheng C, Su X, Rubnitz JE, Basso G, Biondi A, Pui C-H, Downing JR, Campana D. Lancet Oncol 2009 Feb; 10(2): 147-156
10. Figueroa ME, Chen S-C, Andersson AK, Phillips LA, Li Y, Sotzen J, Kundu M, Downing JR, Melnick A, Mullighan CG. J Clin Invest 2013 Jul 1; 123(7): 3099-3111
11. Gaynes JS, Jonart LM, Zamora EA, Naumann JA, Gossai NP, Gordon PM. Haematologica 2017 Apr; 102(4): e136-e139
12. Geng H, Brennan S, Milne TA, Chen W-Y, Li Y, Hurtz C, Kweon S-M, Zickl L, Shojaee S, Neuberg D, Huang C, Biswas D, Xin Y, Racevskis J, Ketterling RP, Luger SM, Lazarus H, Tallman MS, Rowe JM, Litzow MR, Guzman M, Allis CD, Roeder RG, Muschen M, Paietta E, Elemento O, Melnick AN. Cancer Discov 2012 Nov; 2(11): 1004-1023
13. Gossai NP, Gordon PM. Front Pediatr 2017; 5: 90
14. Hoffmann PR. Arch Immunol Ther Exp 2007, 55, 289-297
15. Inaba H, Greaves M, Mullighan CG. Lancet 2013 Jun 1; 381(9881)
16. Jabbour E, O`Brien S, Konopleva M, Kantarjian H. Cancer 2015 Aug 1; vol 121, issue 15, p 2517-2528
17. Jost TR, Borga C, Radaelli E, Romagnani A, Perruzza L, Omadho L, Gazzaniga G, Biongi A, Indraccolo S, Thelen M, te Kronnie G, Grassi F. Journal of Leukocyte Biology 2016 June vol 99 no 6, 1077-1087
18. Karaman S, Mansuroglu B, Kizilbey K, Derman S, Hazar AB. Turk J Med Sci (2015) 45: 329-334
19. Kuhbacher M, Bartel J, Hoppe B, Alber D, Bukalis G, Brauer AU, Behne D, Kyriakopoulos A. Journal of neurochemistry 2009 July vol 110, issue 1, p 133-142
20. Mitchell JH, Nicol F, Beckett GJ, Arthur JR. Journal of Endocrinology (1997) 155, 255-263
21. Mullighan CG. J Clin Invest 2013 Oct 1; 122(10): 3407-3415
22. Nordlund J, Milani L, Lundmark A, Lonnerholm G, Syvanen A-C. PLoS One 2012; 7(4): e34513
23. Ozgen IT, Dagdemir A, Elli M, Saraymen R, Pinarli FG, Fisgin T, Albayrak D, Acar S. J Pediatr Hematol Oncol 2007 Aug vol 29 no 8, 519-522
24. Paziranden A, Assadinejad M, Vossogh P. J Trace Elements Med Biol 1999 vol 13 p 242-246
25. Peters MM, Hill KE, Burk R, Weeber EJ. Metallomics 2014, 6, 25-54
26. Principe Del MI, Maurillo L, Buccisano F, Sconocchia G, Cefalo M, Santis De G, Di Veroli A, Ditto C, Nasso D, Postorino M, Refrigeri M, Attrotto C, Del Poeta G, Lo-Coco F, Amadori S, Venditti A. Mediterr J Hematol Infect Dis 2014; 6(1): e2014075
27. Pui CH. Oncology (Williston Park) 2011 Apr 15; 25(4): 341, 346-7
28. Roman M, Jitaru P, Barbante C. Metallomics 2014, 6, 25-54
29. Shi L, Zhang J, Wu P, Feng K, Li J, Xie Z, Xue P, Cai T, Cui Z, hen X, Hou J, Zhang J, Yang F. Proteome Sci 2009; 7: 7
30. Smirnova OV, Manchouk VT, Savchenko AA. Indian J Med Res 2011 Mar; 133(3): 280-286
31. Takeuchi S, Matsushita M, Zimmermann M, Ikezoe T, Komatsu N, Seriu T, Schrappe M, Bartram CR, Koeffler HP. Leuk Res 2011 Oct; 35(10): 1345-1349
32. Terwilliger T, Abdul-Hay M. Blood Cancer J 2017 Jun; 7(6): e577
33. Wilson EH, Weninger W, Hunter CA. J Clin Invest 2010 May 3; 120(5); 1368-1379
34. Zhang T-N, Liu N. J Dairy Sci 2010 93: 3925-3930